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Science长文:清华大学孟安明院士和陶庆华教授课题组破解胚胎背腹轴建立的秘密

多细胞生命个体从受精卵开始,通过细胞分裂、分化以及细胞运动,逐步打破原有的对称结构,发育为一个具有前后、背腹和左右轴线,可以行使复杂生命活动的成体。阐明体轴建立的细胞和分子机制,对于研究人类生育障碍和相关先天性疾病的发生机制有着重要的借鉴意义。对于背腹轴来讲,各组织的前体细胞沿着胚胎的背腹轴线分布,由于所处胚胎位置的不同,具有不同的发育命运。例如,以外胚层细胞为例,靠近背部的外胚层前体细胞将来发育成脑和脊髓等中枢神经系统组织器官,而靠近腹侧的外胚层前体细胞则发育为皮肤及其附属器官(毛发、汗腺、皮脂腺等)。在上一个世纪20年代,德国胚胎学家Hans Spemann将两栖类动物(蝾螈)原肠胚胚孔背唇细胞移植到另外一枚胚胎的腹侧,发现移植的胚孔背唇细胞可以诱导宿主胚胎腹侧细胞形成包括中枢神经系统在内的新的体轴[1]。这些具有诱导作用的细胞被命名为Spemann’s organizer,Hans Spemann本人也于1935年荣获诺贝尔生理或医学奖(图1)。1933年, 英国学者C.H. Waddington发现鸡胚的原条也具有相似的诱导作用[2]。时间过了大约60年后,在1990年代,美国、英国、日本多位发育生物学家发现在斑马鱼和小鼠等胚胎中同样存在类似的背部组织中心,在移植实验中可以诱导第二体轴的形成[3-5]。因此,在脊椎动物胚胎的背腹轴建立,存在进化上保守的结构和过程。

 

                                  图1:在爪蟾胚胎中验证的Spemann组织中心移植实验。引自[6]


两栖类动物在受精后,植物极的皮质向未来的背部方向发生皮质旋转(Cortical rotation),将定位在植物极、含有调控背部组织中心形成的因子转移并释放到未来的背部区域。在斑马鱼受精卵中,定位在植物极的类似因子通过微管系统以不对称转运的方式向动物极胚盘运输。随后,这些因子在背部区域的细胞中激活经典Wnt信号通路,促进β-catenin蛋白稳定性及其在细胞核内的累积,从而调控背部特异基因表达,建立胚胎背腹轴向。因此,鉴定促进β-catenin蛋白稳定性的母源决定因子,成为该研究领域的中心科学问题。

大量研究表明,Wnt蛋白配体是激活Wnt/β-catenin信号通路的决定因素。当没有Wnt配体的情况下,Axin、APC、CK1和GSK-3β组成的降解复合物与β-catenin结合,导致β-catenin进入泛素化降解途径;而Wnt配体与跨膜受体Frizzled以及辅助受体LRP5/6的结合,使得Axin以Dishevelled依赖的方式上膜结合LRP5/6,从而有效抑制降解复合物的活性,β-catenin变得稳定并进入细胞核发挥转录调控作用。因而,人们普遍认为Wnt蛋白配体应该是最可能的背部决定因子。在2005年,正在美国俄亥俄州辛辛那提儿童医院Janet Heasman实验室做博士后研究的华人学者陶庆华博士发现,使用反义寡核苷酸敲低非洲爪蟾胚胎的Wnt11,引起胚胎背部组织发育缺陷[7]。两年以后,该实验室的Matt Kofron博士的研究表明,Wnt11可通过其辅助受体LRP6激活信号通路,从而确定胚胎背部命运[8]。2011年,美国弗吉尼亚大学Bernard Thisse实验室在《美国科学院院报》撰文,认为Wnt8a是斑马鱼胚胎背部组织形成的决定因素[9]。至此,母源Wnt蛋白配体是脊椎动物胚胎背部决定因子的概念被学术界广泛接受。


     

然而,科学发现的过程往往是艰难而又曲折的历程。早在2000年,哈佛大学医学院的华人学者贺熹教授实验室,发现在爪蟾胚胎中过表达显性失活(Dominant negative mutant)的LRP6突变体,从受体水平抑制Wnt信号通路,并不会导致胚胎背腹轴缺陷[10]。近年来,随着基因编辑技术的发展,使得在多种模式动物中构建遗传性基因突变体成为可能。2018年1月,日本名古屋大学Masahiko Hibia实验室通过转录激活子样效应核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases, TALENs)技术制备了斑马鱼母源Wnt8a突变体,发现缺失母源Wnt8a并没有干扰胚胎背腹轴建立[11]。因此,在脊椎动物胚胎背腹轴建立过程中,Wnt蛋白配体可能并不是真正的背部决定因子,而且β-catenin信号的激活似乎与Wnt配体及其跨膜受体无关。


2018年11月23日,清华大学生命科学学院孟安明院士研究团队,与清华大学生命科学学院陶庆华教授实验室合作,在顶级综合性学术期刊《科学》杂志,以在线长文形式(online research article)发表了题为“Maternal Huluwa dictates the embryonic body axis through β-catenin in vertebrates”的研究性论文,首次报道了一个斑马鱼母源突变体“葫芦娃”(Huluwa, HWA),发现 Huluwa 蛋白定位于囊胚早期未来背侧细胞的细胞膜上,在不依赖于Wnt配体与受体的情况下,促进β-catenin在胞质中稳定,进而转运到核内,决定背部命运与体轴形成[12]。

 “葫芦娃”突变体是孟安明院士实验室发现的一个斑马鱼自发突变体。纯合突变体雌鱼产生的后代缺乏背部组织,表现出严重的腹部化表型,呈葫芦状,故命名为“葫芦娃”。进一步的分析发现此突变体中si:dkeysi:dkey-121h17.7 基因(即huluwa基因)的上游调控区出现了一个约7.3 kb的大片段DNA插入, 致使该基因不能转录。随后,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除了“葫芦娃”基因,发现基因敲除得到的胚胎具有类似的表型。基因回补实验也证明“葫芦娃”基因在背腹轴建立过程中起着至关重要的作用。“葫芦娃”编码的蛋白具有一个23个氨基酸组成的胞外结构域,23个氨基酸的跨膜区,以及248个氨基酸的胞内结构域,特异表达于预定背部细胞的细胞膜上。缺失胞外结构域的“葫芦娃”蛋白突变体仍具有指导背腹轴建立的功能,暗示其功能发挥可能不需要胞外信号(图2)。


                            图2:“葫芦娃”蛋白表达于预定背部细胞的细胞膜上(核内有β-catenin蛋白积聚)。




在分子调控机制方面,翔实的生化分析揭示,“葫芦娃”蛋白通过招募Axin和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶Tankyrase,促进Axin多聚腺苷二磷酸核糖修饰(PARsylation),致使Axin降解,从而在不依赖Wnt配体和受体的情况下提高β-catenin 稳定性,调控胚胎背腹轴形成(图3)。值得注意的是,2018年8月,山东大学石德利教授实验室(现广东医科大学)发现,斑马鱼胚胎的Dishevelled 2和3a母源表达最为丰富,缺失母源和合子Dishevelled 2/3a,胚胎呈现原肠运动与前后轴发育缺陷,但背腹轴的建立不受影响 [13],间接支持了背腹轴形成与Wnt配体和受体无关的观点。有意思的是,“葫芦娃”蛋白在进化上保守性较差。爪蟾的同源蛋白与斑马鱼“葫芦娃”蛋白在序列仅有34%的一致性,但仍然在胚胎发育中发挥着类似功能。虽然目前哺乳动物基因组中没有发现“葫芦娃”同源基因,但可能此类蛋白的二级或三级结构才是其发挥功能的关键。因此,在结构与功能上鉴定哺乳动物“葫芦娃”类似基因,将是未来相关研究工作的重点。

 

                                               图3:“葫芦娃”调控背部组织形成的分子机制。



清华大学生命科学学院孟安明院士和陶庆华教授为该论文的共同通讯作者。清华大学博士研究生晏璐、博士后陈静和朱薛辰为论文共同第一作者。

 

参考文献:

1 ADDIN EN.REFLIST1 Spemann H, Mangold H. The induction of embryonic predispositions by implantation of organizers foreign to the species.Arch Mikrosk Anat En1924;100:599-638.

2 Waddington CH. Induction by the primitive streak and its derivatives in the chick.J Exp Biol1933;10:38-U34.

3 Beddington RS. Induction of a second neural axis by the mouse node.Development1994;120:613-620.

4 Shih J, Fraser SE. Characterizing the zebrafish organizer: microsurgical analysis at the early-shield stage.Development1996;122:1313-1322.

5 Koshida S, Shinya M, Mizuno T, Kuroiwa A, Takeda H. Initial anteroposterior pattern of the zebrafish central nervous system is determined by differential competence of the epiblast.Development1998;125:1957-1966.

6 Wolpert L, Tickle C, Arias AM, Lawrence P, Lumsden A, Robertson E, Meyerowitz E, Smith J. Princeples of Development, fifth edition. Oxford University Press.

7 Tao Q, Yokota C, Puck Het al.Maternal wnt11 activates the canonical wnt signaling pathway required for axis formation in Xenopus embryos.Cell2005;120:857-871.

8 Kofron M, Birsoy B, Houston D, Tao Q, Wylie C, Heasman J. Wnt11/beta-catenin signaling in both oocytes and early embryos acts through LRP6-mediated regulation of axin.Development2007;134:503-513.

9 Lu FI, Thisse C, Thisse B. Identification and mechanism of regulation of the zebrafish dorsal determinant.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America2011;108:15876-15880.

10 Tamai K, Semenov M, Kato Yet al.LDL-receptor-related proteins in Wnt signal transduction.Nature2000;407:530-535.

11 Hino H, Nakanishi A, Seki Ret al.Roles of maternal wnt8a transcripts in axis formation in zebrafish.Developmental biology2018;434:96-107.

12 Yan L CJ, Zhu X, Sun J, Wu X, Shen W, Zhang W, Tao Q, Meng A. . Maternal Huluwa dictates the embryonic body axis through beta-catenin in vertebrates.Science2018;362:eaat1045.

13 Xing YY, Cheng XN, Li YLet al.Mutational analysis of dishevelled genes in zebrafish reveals distinct functions in embryonic patterning and gastrulation cell movements.PLoS genetics2018;14:e1007551.

(撰写:中国细胞生物学学会发育生物学分会副会长,中科院动物所 王强研究员)

 

 










 

 

 

 

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